人源重组蛋白药物安全性评价的思考
从上世纪后半期开始，随着分子生物学研究的不断深入，生物制药（biopharmaceuticals）行业在世界范围内呈现出蓬勃兴起的态势，为多种疾病开辟了新的治疗途径。重组人干扰素（rhuIFN）、重组人白介素（rhuIL）、重组人胰岛素（Insulin）和重组人促红细胞生成素（rhuEPO）等均已于上世纪末在国内上市。与生物技术药物研发高潮相呼应的是，近年来进入临床前安全性评价的该类新药亦逐年递增，但回顾多种重组蛋白/多肽的安全性研究，都或多或少受了小分子化学药物毒理学评价体系的影响，而忽视了重组蛋白的独特属性。
体外合成的人用重组蛋白/多肽在分子构成、药效学机制和体内代谢途径等方面与化药的不同之处已有多篇文献述及，新药非临床研究领域对之已逐渐形成了“具体问题具体分析（case by case）”的安评原则。笔者通过国内外研究进展，结合近年来在工作中遇到的问题，对该类新药安全性评价中的难点和疑点作如下探讨。
1 动物种属/模型的选择 虽然动物体内的许多受体对存在部分差异的人源性配体有一定的宽容性，可与之结合并激活下游信号（如huEPO、huIL-1和huIL-1ra），但许多生物技术药物仍有一定的种属特异性，其生物活性需在特定种属的动物体内才能体现，在化药毒理学研究中常用的Beagle犬和SD大鼠未必是最适宜的试验动物：重组人生长因子-集落刺激因子融合蛋白在猴和犬试验中表现出毒性差异[1]；rhuEPO则在人、猴和大鼠体内表现出不同的生物利用度特点[2]。某一重组蛋白受试物的相关动物可通过其药效学资料或同类产品的毒理学资料获得，但当上述资料缺乏时，则需在毒性试验开始前通过体内（in vivo）和/或体外（in vitro）途径来证实受试物的生物活性，如我实验室利用血糖测试仪证实重组人胰岛素可在SD大鼠体内引起明显的血糖下降、rhuIFN则在非洲绿猴肾细胞（Vero）、犬肾细胞（MDCK）和幼仓鼠肾细胞（BHK）显示出抗单纯疱疹病毒（SHV）的生物活性，据此，我们分别应用SD大鼠和食蟹猴完成了上述两种新药的毒理学研究。当没有试验数据或文献来支持某一受试物在所用实验动物体内的生物活性时，得出的“无毒”或“低毒”结果更值得推敲，因为这种结果有可能是因受试物在动物体内的生物利用度过低或根本无效所导致的。
2 给药剂量的设置 多数情况下实验动物可耐受最大给药量的重组蛋白，因此在生物药物安评早期，为避免药审机构的质疑，往往将高剂量组设为最大给药量来实现高暴露量。为恰当地体现药物的毒性作用、避免不必要的浪费（该类新药的生产成本较高），剂量设置应建立在对药物活性机制充分认识的基础上：
2.1 给药途径与分子量 因胃肠道的酶活性和粘膜对水溶性大分子的吸收屏障作用，重组蛋白类药物通常不用口服途径[3]。静脉注射可保证受试物以最大浓度进入生物系统，而经皮注或肌注的受试物进入血液循环的数量受制于其分子量：16KDa以上的大分子主要被淋巴系统吸收，小于1KDa的则主要吸收入血液[4]。
2.2 受试物与动物细胞的亲合力及结合的可饱和性 受试物只有在与其受体结合后才能发挥药效及与药效相关的毒性反应，当受试物在相关动物体内或来源于该种动物的体外培养细胞上的亲和力明显低于人体细胞时，有必要通过增加给药量来弥补暴露量的不足[5]。某些受体的数量和分布有限，如EPO受体（EPOR）只存在于骨髓中的红系细胞表面，与EPO结合、启动生红细胞过程后，EPO-EPOR复合体被细胞内化，并在溶酶体中降解[6,7]，有研究表明rhuEPO在大鼠骨髓中的内化-清除过程是可饱和的[8]。因此，当大量给予受体能力有限的按受试物如促血小板生成素（TPO）[9]、IFN-β[10]以及白血病抑制因子[11]并不能通过增强其生物活性来体现毒副反应。
2.3 受试物浓度对受体数量的影响 血循环中的胰岛素浓度越高，则肝、脂肪、肌肉和血细胞的胰岛素受体数目越少。胰岛素浓度过高时可加速受体损失，造成原有糖代谢的紊乱。在我实验室完成的重组人胰岛素（rhu-Ins）大鼠毒性试验中，首次给予（s.c）120、60、20 u/kg体重rhu-Ins后在大鼠体内降血糖的速度相似（均在给药后55 min降至2.3~2.6 mmol/L），多次给予（s.c）50、20、8 u/kg体重rhu-Ins后，高剂量组大鼠出现血糖紊乱（高于20 mmol/L），并在禁食后出现死亡；8 u/kg rhu-Ins则在稳定降血糖的同时不影响糖代谢，且无不良反应。由此可见，在50 u/kg可产生明显的生物活性及其相关毒性时，没有必要将给药量增至120 u/kg。
3 人源蛋白在试验动物体内的免疫原性（immunogenicity） 种间差异决定了人用重组蛋白/多肽与实验动物体内的同源蛋白存在不同程度的序列和构象差异，即使是在多种动物间有着较高保守性的EPO（人与大鼠EPO成熟肽的保守性为82%，人与猴之间有92%的氨基酸相似性），仍可被其它种属动物的免疫系统识别而诱生抗体（包括中和抗体）[12-14]，这种由受试物异源性引起的体液和/或细胞免疫应答将从不同方面影响生物药物的临床前安全性评价：
3.1 与药效学无关的毒副反应 包括免疫相关组织的增生、抗药物抗体（anti-drug antibodies, ADA）引起的免疫复合物沉积、ADA与相应内源性蛋白的交叉反应引起的自身免疫疾病、以及细胞免疫应答导致的局部组织损伤等“新毒性效应”。重组人酸性成纤维细胞生长因子(rhaFGF) 连续28 d涂抹家兔破损皮肤后发现免疫器官有明显病理学改变[15]；我实验室完成的一项含血凝因子Ⅷ的生物胶在多次经腹腔注射给予大鼠后，其脾脏发生显著增生（包括重量增加和组织形态学变化）；促血小板生成素抗体经交叉反应引起的血小板减少症、rhuEPO抗体致贫血及huGM-CSF抗体致肺泡内蛋白沉积也已见诸报道[12,16-18]。
3.2 抗体性质的鉴定 越来越多的毒理学工作者已认识到免疫原性对毒性评价的意义，在试验中通过监测动物血清中的ADA来阐明受试物的免疫原性，但这里存在一个误区，即结合抗体和中和抗体概念的混淆，用酶联免疫吸附试验（ELISA）得出的结合抗体（ADA）效价常被作为中和抗体滴度。事实上ADA中只有一部分为中和性抗体，它通过特异性结合药物的受体结合位点而阻断药物的生物学活性。中和抗体滴度须通过专门的生物活性检测手段来体现，如rhuIFN中和抗体可削弱rhuIFN在体外培养细胞上的抗病毒作用[19]；rhuIL-1中和抗体可削弱rhuIL-1在体外培养小鼠胸腺淋巴细胞上的促增殖作用；rhuEPO中和抗体则可降低EPO依赖性细胞HCD57 (+)的生长速率。重复给药毒性试验中检测到的ADA并不是中断给药的合理依据，除非能证实其中含有能中和药物药理和/或毒理作用的中和抗体[5]。
3.3 对毒代动力学（Toxicokinetics, TK）和药效学结果的影响 中和性ADA可通过加快药物清除速率或屏蔽药物的受体结合位点来改变TK和药效学参数[20]，削弱频繁给药可能导致的毒副反应频率和严重程度、掩盖蓄积毒性。非中和抗体却可能延长药物在体内的半衰期[21]。忽视了这一点而将试验结果直接外推到临床人体试验将带来更大危害。
3.4 免疫原性结果在毒理学研究中的意义 免疫应答检测已成为毒理学评价中不可回避的环节[22-23]，但其目的并不是将结果简单地外推到人体反应，而是当出现“无毒性反应”或与药理作用明显无关的“新毒性效应”时，免疫原性可用于对最终评价结果进行合理和必要的补充说明，以此为依据来判断是否要进行更深入的无免疫原性干扰的毒理学研究，如利用对受试物无免疫应答的转基因动物或动物体内的受试物同源蛋白来进行毒性研究[24-26]。
4 毒代动力学（TK）研究 为评价重组蛋白在动物体内的暴露（Exposure）水平，ICH建议在重复给药毒性试验中进行药物代谢动力学和毒物代谢动力学研究。我国学者袁守军认为，重复给药毒性评价结合TK研究的直接好处包括：(1)实验动物的选择；(2)实验动物体内药物暴露状况；(3)长期毒性试验剂量设置合理性判断；(4)药物代谢酶诱导判断；(5)指导毒理学评价中检测指标的设置；(6)判断所谓“低毒性或无毒性药物”可靠性；(7)也能满足当前新药申报的要求，但“国内尚没有看到TK研究在药物安全评价中指导评价研究设计的报告”[27]。包括重组蛋白在内的生物技术药物的TK研究历史不长且极少见到[28]，将是另一个与小分子化药或中药单体药TK研究所不同的广阔天地。
4.1 给药次数与TK参数测定的关系 在单次给药或重复给药试验的首次，动物体内没有针对受试物的ADA，根据不同的给药方式，除少部分受试物被抗原递呈细胞捕获并加工外，其它应以正常的速度到达各靶细胞上的受体上。但在多次给药且体内已有ADA存在时，受试物将首先与循环血中的ADA结合，其与受体结合及从血浆中清除的速度在很大程度上取决于血液中的抗体量和抗体的（非）中和性。因此，在进行TK研究前，应有充分的药效学和免疫学预试资料来支持试验方案。而在检出ADA后，应以TK参数来说明生物利用度的改变，以此作为试验继续或中止的依据。
4.2 重组蛋白TK分析技术
4.2.1 高效液相色谱（HPLC）及其衍生技术 高灵敏性和选择性的HPLC或色谱-质谱联用技术（HPLC-MS/MS）在化学药、中药单体成分和小肽类物质的药代研究或蛋白质的氨基酸分析中发挥了重要作用（王文艳 等，2006；刘莎 等，2006），但从其工作原理来看，并不适合以完整大分子形式发挥生物学活性的重组多肽药物的TK分析。
4.2.2 酶联免疫吸附方法（ELISA） 该法基于重组蛋白分子的免疫学活性，多通过双抗体夹心法、即“固着于固相载体上的捕获抗体-待测血浆-特异性抗体-酶标或荧光标记的第二抗体”这一ELISA过程来滴定血浆中的重组蛋白含量。此法因高度特异性、精确性及相对简便的操作而被广泛用于生物产品的定量。但是基于抗原表位特异性的ELISA法并不能区别已降解/变性的无活性蛋白质和具生物活性的天然蛋白质[29,30]，而将凡是具有该表位并可结合在捕获抗体上的蛋白分子或多肽片段均视作完整的分子。由此可见，蛋白质的免疫反应性并不能完全代表其生物活性的质和量。
4.2.3 荧光偏振免疫分析法（FPIA） 该法依据荧光标记抗原和其抗原抗体结合物之间荧光偏振程度的差异，用竞争性方法直接测量生物样本中受试物分子的含量。荧光标记的小分子抗原在溶液中旋转速度快，荧光偏振光强度小，当与相应抗体结合后，所形成的大分子在溶液中旋转速度变慢，荧光偏振光强度增大。作为一种均相标记免疫分析技术，FPIA具有显著的优点之一是样品分子的测定在溶液中进行，避免了固相标记过程中反复多次的洗涤步骤，实现自动化控制和高通量分析 [31]。但这种方法更适于小分子量的抗原，如苯巴比妥、丙米嗪、甲状腺素和黄体脂酮等，且仍存在如ELISA一样的多肽片段带来的干扰。
4.2.4 放射免疫分析法（RIA） 有学者将放射性同位素外标或内标于目标蛋白的氨基酸，通过RIA来定量重组蛋白的血浆浓度和组织分布[28]，但该法须在证实“放射标记的受试物质仍保持了与非标记物质相当的活性和生物学性质”[5]的前提下进行，同时也存在“脱卤”或因放射性卤素通过代谢掺入内源蛋白中而影响检测结果的可能[32,33]，因此，ICH在生物技术药物的临床前安全性评价指导原则中也明确指出，“解释特定的放射性示踪氨基酸试验时应谨慎，因为氨基酸可进入与药物无关的蛋白质或多肽的再循环”[5]。
5 结语
重组蛋白类药物是模拟人体蛋白质在体外培养细胞中合成的分子，与化学合成药相比，是一种历史较短的药物。最初人们认为既然该类药物源自人体，就应该是安全的，但事实并非如此。虽然国内外药审机构针对这类新药颁布了一系列临床前研究指导原则，但具体研究方案仍需要针对受试物特性来制定，广大毒理学工作者在多年实践中不断深化和完善着这一领域的研究，为人类的安全用药做出了不朽的贡献。
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