摘要：

胚胎干细胞（embryonic stem cells, ES cells）是指从胚胎内细胞团分离获得的，能在体外长期培养并保持自我更新能力和分化为所有三个胚层细胞潜能的正常二倍体细胞。胚胎干细胞的高度自我更新能力和分化全能性是它区别于其它细胞的重要特征，它的特异性分子标志，对于胚胎干细胞的鉴定、分离以及自我更新和分化机制的研究，有着十分重要的意义。我们实验室使用小鼠ES细胞免疫兔，筛选ES细胞特异的兔单克隆抗体，通过免疫共沉淀和质谱技术结合的方法鉴定抗原来筛选胚胎干细胞的特异性分子标志。在本次实验中，我们共筛选到了200多株胚胎干细胞特异性的杂交瘤。细胞免疫荧光和免疫组织化学得结果显示：多数抗体具有较高的特异性，仅在少数成体组织或其它细胞系中有染色现象，并且多数抗体的染色在ES细胞分化后会出现染色变弱或消失的现象，说明这些抗体所针对的抗原随着ES的分化表达降低，这些抗原很有可能会成为未分化胚胎细胞的分子标志。尤其是其中一株杂交瘤59#，它所分泌的抗体只在ES细胞中有阳性染色，其抗原在成体组织中未发现表达，可能会成为一个很好的胚胎干细胞的特异标志。并且我们已经通过免疫共沉淀的方法提取纯化了其中一些抗体所针对的抗原，这些纯化的抗原有待进一步的通过MALDI－TOF等质谱方法来鉴定。

关键词： 胚胎干细胞  特异性标志  兔单克隆抗体

前言

胚胎干细胞是从植入前的胚胎内细胞团分离获得的一类细胞，它能在体外培养过程中长期保持自我更新的能力和分化为所有三胚层细胞的潜能。因此，胚胎干细胞是一种细胞移植治疗的优秀种子细胞来源。[1, 2] 随着不同胚胎干细胞株的建立，胚胎干细胞的标志物也不断被发现，至今已报道的常用的胚胎干细胞特异性标志包括转录因子OCT4、NANOG、REX1等；表面标志物SSEA-1、SSEA-3、TRA-1-60、CD9等。这些标志对胚胎干细胞的鉴定、胚胎干细胞的分化过程中基因和蛋白表达变化的研究起着非常重要的作用。尤其细胞膜表面标志，对细胞因子参与胚胎干细胞的自我更新和分化的机制的研究、未分化胚胎干细胞的分离纯化有着十分重大的意义。单克隆抗体具有高度的特异性，这些胚胎干细胞的特异性标志的抗体的应用能很好地达到这些研究目的。

然而，目前研究资料表明：大部分的胚胎干细胞的特异性标志抗体并不是直接从胚胎干细胞获得的：SSEA-1、SSEA-4、TRA-1-60等抗体是由畸胎瘤细胞免疫获得的；SSEA-3抗体是从小鼠胚胎免疫获得[3-5]；OCT4、NANOG这些转录因子的抗体则直接使用蛋白作为免疫原免疫动物所获得的。这些标志的特异性有一定的局限性：它们在一些成体干细胞、正常组织或癌细胞中也有一定表达[6-10]，胚胎干细胞特异性的膜表面标志数量更是有限。因此，发现更多、更灵敏、更特异的胚胎干细胞标志十分必要。2005年，Son等通过人胚胎干细胞免疫小鼠发现了人胚胎干细胞特异性标志HSP70异性I蛋白，说明使用胚胎干细胞直接作为免疫原有可能发现新的胚胎干细胞标志物[11]。

我们通过用小鼠胚胎干细胞免疫兔制备胚胎干细胞特异性单克隆抗体。与鼠来源的单克隆抗体相比，兔单克隆抗体具有更大的优势：首先，兔对外源抗原反应更为敏感，可以对小鼠无免疫原性的抗原产生抗体；其次，兔单克隆抗体具有更高的亲和力；第三，兔和小鼠来源的抗体对同一种抗原也会识别不同的表位；第四，兔的脾脏更大，可以产生更多的脾细胞进行融合实验，有机会筛选到更多的单克隆抗体[12]。得到ES特异性抗体后，结合免疫共沉淀技术和质谱分析技术，可以分离鉴定抗体所特异结合的胚胎干细胞抗原，有可能筛选得到新的胚胎干细胞特性标志，同时获得大量分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株从而建立胚胎干细胞的抗体库。