苏中渊¹  李颖³  朱伟民²  张铭^1*

¹浙江大学生命科学学院， 浙江 杭州 310058

²杭州宜康生物技术有限公司，浙江 杭州

³浙江省医学科学院， 浙江 杭州

 

基金项目: 本工作由2007年国家重大科学研究计划项目资助“干细胞表面特征与功能”（2007CB947800）经费资助。

通讯作者。E－mail : zhangming_ls@zju.edu.cn (张铭).

 

摘要：

胚胎干细胞（embryonic stem cells, ES cells）是指从胚胎内细胞团分离获得的，能在体外长期培养并保持自我更新能力和分化为所有三个胚层细胞潜能的正常二倍体细胞。胚胎干细胞的高度自我更新能力和分化全能性是它区别于其它细胞的重要特征，它的特异性分子标志，对于胚胎干细胞的鉴定、分离以及自我更新和分化机制的研究，有着十分重要的意义。我们实验室使用小鼠ES细胞免疫兔，筛选ES细胞特异的兔单克隆抗体，通过免疫共沉淀和质谱技术结合的方法鉴定抗原来筛选胚胎干细胞的特异性分子标志。在本次实验中，我们共筛选到了200多株胚胎干细胞特异性的杂交瘤。细胞免疫荧光和免疫组织化学得结果显示：多数抗体具有较高的特异性，仅在少数成体组织或其它细胞系中有染色现象，并且多数抗体的染色在ES细胞分化后会出现染色变弱或消失的现象，说明这些抗体所针对的抗原随着ES的分化表达降低，这些抗原很有可能会成为未分化胚胎细胞的分子标志。尤其是其中一株杂交瘤59#，它所分泌的抗体只在ES细胞中有阳性染色，其抗原在成体组织中未发现表达，可能会成为一个很好的胚胎干细胞的特异标志。并且我们已经通过免疫共沉淀的方法提取纯化了其中一些抗体所针对的抗原，这些纯化的抗原有待进一步的通过MALDI－TOF等质谱方法来鉴定。

 

关键词： 胚胎干细胞  特异性标志  兔单克隆抗体

 

前言

胚胎干细胞是从植入前的胚胎内细胞团分离获得的一类细胞，它能在体外培养过程中长期保持自我更新的能力和分化为所有三胚层细胞的潜能。因此，胚胎干细胞是一种细胞移植治疗的优秀种子细胞来源。[1, 2] 随着不同胚胎干细胞株的建立，胚胎干细胞的标志物也不断被发现，至今已报道的常用的胚胎干细胞特异性标志包括转录因子OCT4、NANOG、REX1等；表面标志物SSEA-1、SSEA-3、TRA-1-60、CD9等。这些标志对胚胎干细胞的鉴定、胚胎干细胞的分化过程中基因和蛋白表达变化的研究起着非常重要的作用。尤其细胞膜表面标志，对细胞因子参与胚胎干细胞的自我更新和分化的机制的研究、未分化胚胎干细胞的分离纯化有着十分重大的意义。单克隆抗体具有高度的特异性，这些胚胎干细胞的特异性标志的抗体的应用能很好地达到这些研究目的。

然而，目前研究资料表明：大部分的胚胎干细胞的特异性标志抗体并不是直接从胚胎干细胞获得的：SSEA-1、SSEA-4、TRA-1-60等抗体是由畸胎瘤细胞免疫获得的；SSEA-3抗体是从小鼠胚胎免疫获得[3-5]；OCT4、NANOG这些转录因子的抗体则直接使用蛋白作为免疫原免疫动物所获得的。这些标志的特异性有一定的局限性：它们在一些成体干细胞、正常组织或癌细胞中也有一定表达[6-10]，胚胎干细胞特异性的膜表面标志数量更是有限。因此，发现更多、更灵敏、更特异的胚胎干细胞标志十分必要。2005年，Son等通过人胚胎干细胞免疫小鼠发现了人胚胎干细胞特异性标志HSP70异性I蛋白，说明使用胚胎干细胞直接作为免疫原有可能发现新的胚胎干细胞标志物[11]。

我们通过用小鼠胚胎干细胞免疫兔制备胚胎干细胞特异性单克隆抗体。与鼠来源的单克隆抗体相比，兔单克隆抗体具有更大的优势：首先，兔对外源抗原反应更为敏感，可以对小鼠无免疫原性的抗原产生抗体；其次，兔单克隆抗体具有更高的亲和力；第三，兔和小鼠来源的抗体对同一种抗原也会识别不同的表位；第四，兔的脾脏更大，可以产生更多的脾细胞进行融合实验，有机会筛选到更多的单克隆抗体[12]。得到ES特异性抗体后，结合免疫共沉淀技术和质谱分析技术，可以分离鉴定抗体所特异结合的胚胎干细胞抗原，有可能筛选得到新的胚胎干细胞特性标志，同时获得大量分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株从而建立胚胎干细胞的抗体库。

 

材料和方法：

细胞系及实验动物：小鼠胚胎成纤维细胞取自本实验室妊娠13.5d的ICR小鼠

小鼠胚胎干细胞（J2细胞系）；129小鼠建系胚胎干细胞系（实验室自建）

ICR 小鼠：浙江省医学科学院

2.5-3个月大的新西兰大白兔

主要试剂：

H-DMEM (Sigma)

1640 (Sigma)

β-巯基乙醇 (Sigma)

非必需氨基酸（Gibco）

L－谷氨酰胺 （Gibco）

丝裂霉素C

胎牛血清（FBS）（杭州四季青）

小牛血清（FCS）（杭州四季青）

DMSO

EDTA

明胶（Sigma）

mLIF（Chemicon）

青霉素、链霉素

常规化学试剂：NaCl、KCl、NaH₂PO₄、K₂HPO、苯酚、氯仿等为国产分析纯

多聚甲醛（Sigma）

山羊血清

牛血清白蛋白

FITC荧光二抗

PowerVision 免疫组织化学二抗

DAB试剂盒（中杉金桥）

非变性裂解缓冲液：1%（W/V）Triton X-100(室温避光保存)，50mM Tris•HCl pH 7.4，300mM NaCl，5mM EDTA，0.02%（W/V）NaN₃。4℃可保存6个月。使用前加入10mM 碘乙酰胺，1mM PMSF（溶于100%乙醇中100mM -20℃保存，可达6个月），2微克/ml亮肽素（纯水中10mg/ml，-20℃保存，可达6个月）

洗涤缓冲液：0.1%（w/v）Triton X-100, 1%（W/V）Triton X-100(室温避光保存)，

50mM Tris•HCl pH 7.4，300mM NaCl，5mM EDTA，0.02%（W/V）NaN₃ 。

 方法：

1、     小鼠胚胎干细胞（mES）的培养和扩增

以1%非必须氨基酸(NEAA)＋0.1mM BME＋2mML-Glu+10ng/ml＋85%DMEM＋15%FBS+10ng/ml Lif作为培养基培养小鼠胚胎干细胞，同时以孕期13.5天的小鼠胚胎制备的成纤维细胞作为饲养层。当mES生长至80％左右的满度时，以0.05％胰酶＋0.02%EDTA消化传代。

2、     mES拟胚体自发分化

ES细胞消化为单细胞后，通过差速帖璧去除MEF，按5*10⁵/ml 接入细菌培养皿，同时撤去LIF培养于EB培养液中（1%非必须氨基酸＋0.1mM BME＋2mML-Glu＋85%DMEM＋12.5%FBS）。悬浮培养6天后将形成的拟胚体接入24孔板继续培养6天。

3、    mES抗体制备

3.1、mES细胞的免疫。准备5*10⁷-1*10⁸mES细胞，PBS洗涤后，0.1%EDTA消化5-10min。收集5*10⁷的细胞量，PBS离心洗涤3次，最后用1ml PBS重悬，与等体积福氏完全佐剂混合。选取3个月大的新西兰大白兔，背部选取十个位点，0.2ml/点皮内注射。3周后每隔两周以步骤2-3同样方法免疫，由福氏不完全佐剂代替福氏完全佐剂。4次免疫后，耳缘静脉取血ICC检测，设置不同血清稀释度：1：100，1：200，1：500，1：2000。根据检测结果判断血清抗体滴度是否达到融合要求。两周之后，取1*10⁸ES细胞量直接腹腔注射加强免疫。

3.2  、细胞融合。加强免疫4天后，取脾，迅速将其放入含PBS的离心管中，1h   内用于融合。在无菌环境下取出脾细胞，离心去上清。加入5ml红细胞裂解液，混匀后静置5min。离心去上清，加入5ml无血清培养液悬浮，计数。加入与免疫脾细胞来源相同的永生化HRGTP^-的B细胞240E-W2，免疫脾细胞和204E-W2细胞比例为2：1。混匀后，于50ml离心管中1000RPM离心5min，去上清，尽量将液体吸尽。加入预热到37℃的PEG4000 1ml，边加边用枪头轻轻混匀，1min内加完，静置90s。然后加入无血清培养液稀释，30s加1ml，再30s加5ml，然后1min内加入35ml培养液，盖好离心管盖子，缓慢上下颠倒混匀一次后，静置1min。1500RPM 5min离心，去上清，加入15%FCS培养液，混匀。以1*10⁴/CM²接种到96孔板中，共铺60板块。72h后换成HAT培养液。5-6天换液一次，观察克隆生长情况，15天后取上清ICC检测阳性孔。

3.3、杂交瘤阳性孔筛选（ICC）

①    固定：吸出96孔中的培养液后， PBS洗涤2次，然后加入4％多聚甲醛37 ℃固定1h。

②    透膜：加入0.5%Triton X-100，37℃孵育30min。

③    封闭：吸去Triton X-100后，PBS洗涤2次，加入1%BSA，37℃孵育30min。

④    封闭完成后，吸去液体，PBS洗涤2次，加入杂交瘤上清液70-100μl，37℃孵育1h。

⑤    吸去上清液后，PBS洗涤2次，加入荧光标记的山羊抗兔的二抗（1：1000稀释），37℃孵育1h。吸去二抗，PBS洗涤3次后，荧光镜检。

3.4、亚克隆。取ICC检测阳性孔，将细胞密度调整到30个/ml，然后以100μl/孔铺到96孔板上，每孔补加100μl1*10⁴/cm²的240E-W2细胞作为饲养层细胞。18天后，取杂交瘤上清ICC检测亚克隆阳性率。

4、杂交瘤分泌抗体特异性的初步鉴定

4.1、选用几种不同的细胞系进行ICC检测，检测所获得抗体的特异性情况。所选取的细胞株包括：J3、D3、S8三株小鼠胚胎干细胞、实验室自建人胚胎干细胞系一株、SNL与MEF两种常用于支持ES细胞生长的成纤维细胞。

4.2、利用ICC检测mES形成拟胚体自发分化后的抗体所针对的抗原的表达分布。

4.3、检测抗体所针对抗原在成体组织中的分布。

4.3.1、组织冰冻切片的制备。

①    将小鼠引颈处死后，立即取其肾、脑、肝、心、小肠和肺这些器官。

②    解剖获得组织后置于３０％蔗糖脱水3天以上至组织块下沉。

③    载玻片处理：载玻片先在洗洁液（或洗衣粉溶液）中煮沸30min，清水洗净后放入清洁液中浸泡12-24h，漂洗，用蒸馏水清洗后烘干，然后涂以切片黏合剂。

④    取出组织用包埋剂包埋后，-80℃冷冻5min以上，然后迅速将其取出置于已添加包埋剂的固定架上，-20℃中平衡20min以上。

⑤    以6-8微米的厚度切片。

⑥    切完后，-80℃保存，或干燥过夜后，4℃保存。

4.3.2、切片的免疫组织化学（IHC）

①    取出冰冻切片，室温放置30分钟后，入4℃多聚甲醛中固定15分钟，PBS洗，5分钟×3。

②    用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2。

③    5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。

④    倾去血清，PBS洗3分钟，滴加含不同抗体的杂交瘤上清，37℃孵育1小时或4℃过夜。PBS冲洗，5分钟×3次。

⑤    滴加适当1：1稀释的二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育30分钟。PBS冲洗，5分钟×3次。

⑥    加入显色剂显色（DAB），避光，10-20min，显色完全即可终止。

⑦    自来水充分冲洗。

⑧    苏木精复染3min，盐酸酒精分色20s，自来水冲洗后封片。

5、免疫沉淀纯化抗原

取100μl ICC杂交瘤上清加入900μl PBS后混匀，加入20μl 50％proA（w/v），4℃摇晃过夜。离心取微珠沉淀，PBS离心洗涤3次，冰上保存备用。取10⁷的mES细胞，非变性裂解液裂解后，在4℃16000RPM离心15min，取上清加入100μl 50％proA 4℃作用2h，预清除非特异性结合蛋白。离心取上清，加入制备好的结合抗体的proA微珠，4℃作用2h。离心去上清，洗涤缓冲液离心洗涤3次后，去上清加入20μl PBS，取该悬液SDS-PAGE，银染检测分离纯化的抗原。

6、westernblot

取10⁷的mES加入1ml 8M尿素裂解后，4℃16000RPM离心15min取上清，以该上清SDS-PAGE分离蛋白后，转硝酸纤维素膜，70V湿转50min。将膜用移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭2h。加入一抗即杂交瘤上清，孵育1h，1xTBST洗10minx3次。加入二抗孵育1h，1xTBST洗10minx3次。加入底物显色3min，曝光3min。

 

实验结果

1．抗体的制备和筛选：

为了不破坏胚胎干细胞（ES）的表面抗原，使用EDTA代替胰酶来消化获取ES细胞，并离心洗涤尽量去除培养液中血清的影响。由于ES能在体内产生畸胎瘤，所以在免疫兔子之前，使用CFA或IFA与ES混合乳化30min使之失活。在第四次免疫之后，通过耳静脉取血，对血清中的抗血清滴度进行检测。抗血清细胞免疫荧光检测为阳性。滴度符合实验需要，即可进行加强免疫，之后取脾细胞进行细胞融合。血清1：2000稀释后仍可见荧光，血清中可结合ES细胞中的抗体浓度较高。

加强免疫处死兔子后取脾细胞融合后两周观察，融合率约为56%。经ICC检测阳性率为6.5%，共获得206个阳性孔。将这些阳性孔从96孔板转移至24孔板扩大培养，一周后取上清ICC检测。过程中，由于细胞死亡，和阳性孔丢失等原因，获得100个阳性孔。在这些阳性孔中，

在筛选过程中出现很多不同染色情况的抗体，说明这些杂交瘤所分泌的抗体可结合不同的抗原。由于免疫的过程中混有MEF细胞，在筛选过程中出现很多结合MEF的抗体，但也存在只结合ES细胞的抗体，或与MEF结合较弱的抗体，这部分抗体正是我们所需要的ES特异性的抗体。

我们选取了20个mES阳性较强，特异性较好的杂交瘤，调整细胞状态后进行亚克隆。最后获得14株ES阳性杂交瘤细胞株。按初筛时的编号进行命名。对亚克隆后的抗体ICC检测通过Confocol观察发现：这些抗体的染色情况并不完全相同，有些抗体结合细胞膜表面抗原，而有些结合胞内抗原；抗体的特异性也存在差异。