赵丽英，卓婷婷，陈 智[1]

作者单位：310003 杭州，浙江大学医学院附属第一医院传染病研究所，传染病诊治国家重点实验室

[摘要] 目的 研究慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者和乙型肝炎病毒携带者（asymptomatic HBV carriers，ASC）外周血CD4⁺CD25⁺调节性T细胞（CD4⁺CD25⁺ regulatory T cells，Tregs）中部分重要分子的表达情况，并分析其可能的作用。方法 收集27例CHB患者、11例ASC和24例健康献血者的外周静脉血，密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，应用MACS免疫磁珠和AutoMACS分离系统分选CD4⁺CD25⁺ Tregs，提取CD4⁺CD25⁺ Tregs总RNA，逆转录成cDNA后，采用SYBR Green I荧光标记技术进行定量PCR检测待测分子的表达水平。结果 荧光定量PCR结果显示，8个待测分子中，CCR5、CTLA-4、Foxp3、ICAM-1、Neuropilin-1、TLR5的表达水平在各研究组之间差异均无统计学意义（P>0.05）；GITR在CHB组外周血CD4⁺CD25⁺ Tregs中的表达水平明显高于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.05），而GITR的表达水平在CHB组和ASC组之间及ASC组和健康对照组之间差异均无统计学意义；TLR8在ASC组外周血CD4⁺CD25⁺ Tregs中的表达水平明显低于健康对照组和CHB组，差异有统计学意义（P<0.05），TLR8的表达水平在CHB组和健康对照组之间差异无统计学意义（P>0.05）。结论 荧光定量PCR显示GITR、TLR8的表达水平在各研究组之间存在显著性差异，提示GITR和TLR8在HBV感染过程中可能对外周血CD4⁺CD25⁺ Tregs的功能起着重要的调控作用。

[关键词] CD4⁺CD25⁺ 调节性T细胞；乙型肝炎；荧光定量PCR；GITR

 

Research on several expressed molecµles of CD4⁺CD25⁺ regµlatory T cells in peripheral blood of chronic hepatitis B patients

ZHAO LI-ying*, ZHUO TING-ting, CHEN Zhi. * Institute of Infectious Diseases, National Key Laboratory of Infectious Diseases, First Affiliated Hospital, College of Medicine, Zhejiang University, Hangzhou, 310003, China.

[Abstract] Objective to analyze the expression of several important molecµles of  CD4⁺CD25⁺   regµlatory  T cells(Tregs) in peripheral blood of chronic hepatitis B patients and asymptomatic HBV carriers，and to investigate their potential functions. Methods 27 chronic hepatitis B (CHB) patients, 11 asymptomatic HBV carriers (ASC) and 24 healthy blood donators were enrolled in this study. PBMC from CHB, ASC and healthy blood donators were isolated by Ficoll-Hypaque density gradient centrifugation. CD4⁺CD25⁺ Tregs were isolated by using CD4⁺CD25⁺ regµlatory T Cell Isolation Kit, and autoMACS Separator(Miltenyi Biotec Inc). Then the total RNA of them was extracted. After reverse transcription, We developed and evaluated a rapid and reliable Real-Time PCR approach using Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR technology for validation of this partial resµlts of hybridization. Resµlts The resµlts of Real-Time PCR demonstrated that the expression of CCR5, CTLA-4, Foxp3, ICAM-1, Neuropilin-1 and TLR5 showed no significant difference in circµlating CD4⁺CD25⁺  Tregs from different groups. CHB patients presented a higher expression of GITR of circµlating CD4⁺CD25⁺  Tregs than those in normal controls (P<0.05), but there was no significant difference of GITR expression in circµlating CD4⁺CD25⁺ Tregs among the other groups. ASC presented a lower expression of TLR8 of circµlating CD4⁺CD25⁺ Tregs than those in CHB patients and normal controls (P<0.05), but there was no significant difference of TLR8 expression in circµlating CD4⁺CD25⁺ Tregs between CHB and normal controls (P>0.05). Conclusions The resµlts of Real-Time PCR demonstrated that there were significant difference of GITR expression and TLR8 expression in circµlating CD4⁺CD25⁺ Tregs among different groups. GITR and TLR8 may play a important role in dominant immunological self-tolerance maintained by CD4⁺CD25⁺ Tregs after HBV infection.

[Key words] CD4⁺CD25⁺ regµlatory T cells; hepatitis B; Real-Time PCR; GITR

 

CD4⁺CD25⁺调节性T细胞(Tregs)自1995年Sakaguchi等^[1]首先提出之后，引起了免疫学界越来越多的关注。目前多数学者认为CD4⁺CD25⁺ Tregs在自身免疫反应、抗肿瘤免疫、抗感染免疫、抗移植免疫中发挥着重要作用。CD4⁺CD25⁺ Tregs占人外周血CD4⁺ T细胞的5%～10%，但具有免疫调节活性的细胞主要集中在高表达CD25的CD4⁺细胞（CD4⁺CD25^high）中，占人外周血CD4⁺ T细胞的2％左右。CD4⁺CD25⁺ Tregs可组成性表达许多细胞表面分子，但迄今为止，尚未见有对该类细胞膜表面所有特征性表型分子详尽描述的报道。

有研究报道，HIV、HCV感染者体内均发现CD4⁺CD25⁺ T细胞比例升高，并能抑制病毒特异性的T细胞反应^{[2, 3]}。最近，在HBV感染患者中发现CD4⁺CD25^high调节性T细胞，能抑制HBV特异性的CTL效应^[4]，且CD4⁺CD25^high调节性T细胞频率与病毒载量正相关^{[5, 6]}。但在HBV感染的不同阶段，患者外周血CD4⁺CD25⁺ Tregs特征分子的变化情况，目前报道很少，故本研究参考了国内外大量文献，从CD4⁺CD25⁺ Tregs的表面分子中挑选出公认的8个重要分子进行研究，它们分别是CCR5、CTLA-4、Foxp3、ICAM-1、GITR、TLR5、TLR8和Neuropilin-1。本研究收集了27例CHB患者、11例ASC和24例正常献血者，用荧光定量PCR方法检测了这些标本外周血CD4⁺CD25⁺ Tregs中上述8个重要分子的表达情况，以进一步明确Tregs在HBV感染不同阶段的特征及其对病毒持续的影响。

对象与方法

一、研究对象

CHB患者组27例，所有患者纳入前6个月内未接受抗病毒或免疫调节治疗。ASC组11例，CHB患者和ASC均为浙江大学医学院附属第一医院的住院及门诊患者。以上所有患者均排除HAV、HCV、HDV、HEV和HIV感染，诊断符合2000年西安全国传染病寄生虫病学术会议修订的《病毒性肝炎防治方案》所定的标准^[7]。同时，还采集了健康对照组24例，所有患者和健康献血者在献血前签署知情同意书。患者及对照入组时的一般情况见表1。

二、主要试剂和仪器

淋巴细胞分离液（1.077g/ml）为荷兰Cedarlane’s公司产品，人CD4⁺CD25⁺ Tregs磁珠分离试剂盒为德国美天旎公司产品，Trizol、β-actin均为美国Invitrogen公司产品，RNasin Ribonuclease Inhibitor、M-MLV Reverse Transcriptase、GoTaq Flexi DNA Polymerase、dNTP Mix均购自美国Promega公司，AutoMACS分离系统购自德国Miltenyi公司、FACSCalibur型流式细胞仪购自美国BD公司、7500 Real Time PCR仪购自美国Applied Biosystems公司。

三、方法

1、生化指标检测：血清ALT、AST测定采用美国Beckman Coµlter CX5PRO全自动生化分析仪及其配套试剂检测，ALT >40 U/L、AST >40 U/L为异常，所有检测均严格按照试剂说明书进行操作。

2、血清标记物检测：HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc 及抗-HCV、抗-HDV、抗-HEV、抗-HIV采用微粒子酶联免疫法(MEIA)检测；HBV DNA定量采用荧光定量PCR 检测，检测下限值为1000拷贝/mL。

3、密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）：取新鲜采集的肝素钠抗凝全血10ml，RPMI 1640不完全培养基以1:1比例稀释，加至淋巴细胞分离液上层，2500 rmp/min，离心20min，取中间白膜层（即单核细胞和淋巴细胞富集层），PBS洗涤2次，加入红细胞裂解液，37℃温育5 min，离心洗涤，收集PBMC。

4、免疫磁珠法分选CD4⁺CD25⁺ Tregs：应用MACS免疫磁珠和AutoMACS分离系统（Miltenyi Biotech，浙江大学免疫学研究所提供），按照试剂盒说明，先以单克隆抗体混合物标记所有非CD4⁺ T细胞群，阴性分选获得CD4⁺ T细胞，再经连有磁珠的抗CD25抗体标记，阳性分选获得CD4⁺CD25⁺ T细胞亚群，流式细胞术鉴定细胞纯度。最终得到CD4⁺，CD4^－，CD4⁺CD25⁺，CD4⁺CD25^－共四群细胞。

5、CD4⁺CD25⁺ T细胞总RNA 提取：使用Invitrogen公司的Trizol试剂进行RNA的一步法提取，具体操作参照说明书进行。所使用的器皿和器材均进行RNase的灭活处理。取适当稀释的RNA样品，紫外分光光度仪测定其浓度，并经甲醛变性凝胶电泳鉴定其纯度。

6、cDNA合成：在去核酸酶的Eppendorf管中加入RNA 5µl，Oligo（dT）18（50pmol）2.5µl，70℃温浴5min，立即放置冰上至少2min；然后在同一Eppendorf管中加入5×M-MLV buffer 5µl，RNasin Ribonuclease Inhibitor 0.65µl，dNTP Mix（10mmol/l）5µl，M-MLV Reverse Transcriptase 1µl，最后加DEPC处理水至25µl，混合均匀，42℃温浴1小时，70℃温浴10min终止反应，4℃冷却，－20℃冻存备用。

7、DNA扩增：常规PCR反应体系如下:5×buffer 5µl，dNTP Mix（10mmol/L）0.5µl，MgCl2（25mmol/L）2µl，上游引物（10pmol/L）1µl，下游引物（10pmol/L）1µl，GoTaq Flexi DNA Polymerase 0.125µl，cDNA模板 2µl，加双蒸水补足至25µl，扩增条件为：95℃预变性5min，然后95℃变性20s，55－58℃退火20s，72℃延伸20s，共30－35个循环，最后72℃延长7min。取PCR扩增产物10µl与2µl溴酚蓝混合，加至1.5%琼脂糖凝胶中电泳（80伏）20min，多功能凝胶图像成像仪下观察结果。

8、实时荧光定量PCR：采用SYBR Green I Mixture，PCR反应体系如下：SYBR Green I Mixture 2µl，上游引物（10pmol/L）0.5µl，下游引物（10pmol/L）0.5µl，cDNA 1µl，加双蒸水补足至20µl。使用Applied Biosystems 7500 Real-time PCR仪，95℃预变性30s，然后95℃变性15s，58℃退火10s，72℃延伸40s，共40个循环。反应结束后，得到基因扩增曲线，并自动计算出各管DNA的定量结果。

9、统计学分析：数据以x ± s表示，采用SPSS13.0统计软件对测得数据进行分析。先对各组数据进行正态性检验，对于满足正态分布的数据则进行单因素方差分析，对于满足方差齐性的数据则进行方差分析，对于不满足方差齐性的数据则进行多样本资料的非参数检验（即Kruskal-Wallis Test），对于方差分析检验结果显示有差别的采用scheffe方法进行两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、生化指标及血清标记物检测结果

CHB患者、ASC及健康对照组的血清ALT、AST及血清标记物检测结果见表2

二、MACS免疫磁珠分选CD4⁺CD25⁺ Tregs的纯度鉴定

应用MACS免疫磁珠分选CD4⁺、CD4^-、CD4⁺CD25^- T细胞的纯度均大于或等于90％，分选的CD4⁺CD25⁺ Tregs纯度大于90％。（见图1）

三、总RNA浓度及完整性鉴定结果

所有样品用紫外分光光度计法测定OD260和OD280，A260/A280值均在1.8-2.1之间，并取5µl总RNA溶液经甲醛变性凝胶电泳，在紫外线下可见18S及28S两条明亮清晰的条带。（见图2）

四、常规PCR扩增结果

将待测标本的cDNA用GAPDH做引物进行PCR扩增后，产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，在多功能凝胶图像成像仪下观察结果。（见图3）

五、荧光定量PCR结果

用参照基因（GAPDH）作为内对照，通过检测模板梯度稀释时的Ct值变化，来评价目的基因和参照基因是否有相同的扩增效率。本研究目的基因和参照基因的扩增效率大体一致，故可用相对定量法进行分析。

相对定量具体公式如下：△C(t)sample = C(t)target - C(t)reference

                      △C(t)calibrator = C(t)target - C(t)reference

△△C(t) =△C(t)sample -△C(t)calibrator

NRQ(normalized relative quantity)=2^{﹣△△C(t)}

荧光定量PCR仪检测到的各研究组15个目的基因的△Ct值见表3。

CHB组、ASC组和健康对照组外周血总CD4⁺CD25⁺ Tregs中8个标记分子的相对表达水平见图4，将健康对照组目的基因的NRQ设为基础值1。

六、统计结果

采用SPSS13.0统计软件对各研究组外周血总CD4⁺CD25⁺ Tregs中8个标记分子的ΔCt值进行统计分析，结果发现CCR5、CTLA-4、Foxp3、ICAM-1、Neuropilin-1、TLR5的表达水平在各研究组之间差异均无统计学意义（P>0.05）；GITR在CHB组外周血总CD4⁺CD25⁺ Tregs中的表达水平明显高于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.05），而GITR的表达水平在CHB组和ASC组之间及ASC组和健康对照组之间差异均无统计学意义；TLR8在ASC组外周血总CD4⁺CD25⁺ Tregs中的表达水平明显低于健康对照组和CHB组，差异有统计学意义（P<0.05），而TLR8的表达水平在CHB组和健康对照组之间差异无统计学意义（P>0.05）。

讨 论

近年来，具有免疫抑制作用的CD4⁺CD25⁺ Tregs被认为是引起外周免疫耐受的一个重要原因^[8]。Xu等^[9]研究发现，慢性重型乙肝患者外周血中CD4⁺CD25^high T细胞频率显著高于健康对照、CHB患者及早期AHB患者。Peng等^[10]研究发现CD4⁺CD25^high T细胞频率在HBeAg阳性CHB组明显高于健康对照组和AHB组，差异有统计学意义（P值均<0.05），但与HBeAg阴性CHB组及ASC组之间差异无统计学意义，AHB组与健康对照组之间差异亦无统计学意义。Yang等^[11]研究发现，ASC中CD4⁺CD25⁺ Foxp3⁺ Tregs的频率明显高于健康对照。现已证实CD4⁺CD25⁺ Tregs上有许多重要的表面分子，如CD25、GITR及 CTLA-4等，可用于与其他亚群的T细胞进行区别。但目前认为，这些表面标志都不是特异性的，虽然它们在Tregs上呈组成性的高表达，但其他亚群的T细胞（如CD4⁺CD25^-效应性T细胞）活化后也可表达。目前多数学者认为转录因子Foxp3特异的表达在Tregs中，是Tregs一个特征性的标志。

本研究结果显示，CD4⁺CD25⁺ Tregs的特征分子Foxp3的mRNA表达水平在CHB组、ASC组和健康对照组之间差异均无统计学意义（P>0.05），分析原因可能为Foxp3作为CD4⁺CD25⁺ Tregs的特异标志，它的表达水平应与CD4⁺CD25⁺ Tregs的数量成正比，而本研究分析的是CD4⁺CD25⁺ Tregs中Foxp3的平均表达水平，故各研究组之间不会有差异，国外文献报道的是CHB患者血清中或PBMC中Foxp3 mRNA的表达水平高于健康对照。

本研究发现，GITR在CHB组外周血总CD4⁺CD25⁺ Tregs中的表达水平明显高于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.05），而GITR的表达水平在CHB组和ASC组之间及ASC组和健康对照组之间差异均无统计学意义。提示CHB组调节性T细胞的频率高于健康对照组，并且高水平的GITR可以增强CD4⁺CD25⁺ Tregs免疫抑制功能的发挥，这也许是HBV持续感染的一个重要原因。因此，我们将在下一阶段重点研究CHB患者调节性T细胞GITR的蛋白表达情况及其对Treg功能的调节机制。GITR为最近发现的一种肿瘤坏死因子受体超家族（TNFRSF）成员，主要表达在胸腺和外周淋巴器官的静息性Treg细胞上，CD4⁺CD25^- T细胞、巨噬细胞及树突状细胞上也有少量表达，但在细胞活化后GITR的表达增加。Shimizu等^[12]用流式细胞仪检测GITR在BALB/c小鼠中的分布，发现其在脾和淋巴结的Treg细胞及胸腺中CD4⁺CD25⁺ 细胞上均呈高表达。胸腺中的CD4⁺CD25^- 细胞、CD8⁺ 细胞及CD4^-CD25^- 细胞上也有低量表达，但CD4⁺CD8⁺ 细胞上几乎不表达GITR。GITR在胸腺细胞上表达的不同，提示其可能参与了Treg细胞在胸腺中的发育。

我们的研究还发现TLR8在ASC组外周血总CD4⁺CD25⁺ Tregs中的表达水平明显低于健康对照组和CHB组，差异有统计学意义（P<0.05），而其在CHB组和健康对照组之间差异无统计学意义（P>0.05），笔者推测这可能与ASC的树突状细胞（dendritic cells，DC）受到损害有关。有研究发现，HBV感染者的DC中发现了HBV颗粒，DC分泌IFN-γ的水平下降，可能与该细胞内和病毒识别相关的TLR8、TLR9的表达受到抑制有关^[13]。这或许也能解释ASC外周血总CD4⁺CD25⁺ Tregs中TLR8表达下调的原因了。CHB患者虽然DC也受到损害，但由于肝脏发生明显的炎症反应，引起一系列细胞因子的释放，这些细胞因子可能与调节性T细胞TLR8表达上调有关。HBV感染者DC功能的损伤目前已成为乙肝研究的一大热点。研究也发现和TLR8同一家族的TLR5的表达水平在CHB组、ASC组和健康对照组之间差异均无统计学意义。推测TLR5可能对CD4⁺CD25⁺ Tregs不产生直接作用。因为曾有报道，用TLR5的配体直接刺激人CD4⁺CD25⁺ Tregs，虽不能使其增殖，但却促进Foxp3的表达。

本研究也发现CCR5、CTLA-4、ICAM-1、Neuropilin-1这些分子mRNA的表达水平在CHB组、ASC组和健康对照组之间差异均无统计学意义。提示这些细胞因子在各研究组间基因水平的表达差异并不明显，我们将在下一阶段对这些细胞因子蛋白的表达水平进行分析以进一步探讨这些分子是否真正参与了慢乙肝发病过程中对CD4⁺CD25⁺ Tregs功能的调节。

综上所述，本研究发现GITR在CHB组外周血总CD4⁺CD25⁺ Tregs中的表达水平明显高于健康对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；TLR8在ASC组外周血总CD4⁺CD25⁺ Tregs中的表达水平明显低于健康对照组和CHB组，差异有统计学意义（P<0.05），提示CD4⁺CD25⁺ Tregs在HBV感染后病毒清除和病程演化过程中可能发挥了重要的作用，而GITR和TLR8两个分子可能对CD4⁺CD25⁺ Tregs的功能发挥起着关键的作用。当然，进一步了解Treg细胞在HBV感染中的功能变化和相关的作用机制，尤其是其在肝脏原位的作用情况，将更有利于我们揭示HBV持续感染的免疫耐受机制和探讨更为直接有效的抗HBV感染的免疫治疗途径。

 

参考文献:

1、Sakaguehi S, Sakaguehi N, Asano M, et a1. Immunologic tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha－chains(CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol, 1995, 155(3): 1151-1164.

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9、Xu D, Fu J, Jin L, et al. Circµlating and liver resident CD4⁺CD25⁺ regµlatory T cells actively influence the antiviral immune response and disease progression in patients with hepatitis B. J Immunol, 2006, 177(1):739-747.

10、Peng G, Li S, Wu W, et al. Circµlating CD4⁺CD25⁺ regµlatory T cells correlate with chronic hepatitis B infection. Immunology, 2007, 123: 57-65.

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表1 各组患者和健康对照入组时一般情况

分组	CHB	ASC	NC
例数	27	11	24
性别（男/女） 年龄（x±s）岁                ALT(U/L) AST(U/L) HBsAg（+/-） HBsAb（+/-） HBeAg（+/-） HBeAb（+/-） HBcAb（+/-） HBV-DNA（+/-）	21/6 35.3±11.4 187.5±73.6 90.2±42.5 27/0 0/27 16/11 11/16 27/0 27/0	6/5 28.7±10.0 <40 <40 11/0 0/11 7/4 4/7 11/0 7/4	13/11 30.8±5.9 <40 <40 0/24 24/0 0/24 0/24 0/24 0/24

注: CHB，慢性乙型肝炎组；ASC，HBV病毒携带者组；NC，健康对照组；数据示：平均值±标准差；括号中 + 和 − 代表血清相应抗原的阳性和阴性。

 

表2  血清ALT、AST及血清标记物检测结果

分组	CHB	ASC	NC
例数 ALT(U/L) AST(U/L) HBsAg（+/-） HBsAb（+/-） HBeAg（+/-） HBeAb（+/-） HBcAb（+/-） HBV-DNA（+/-）	27 187.5±73.6 90.2±42.5 27/0 0/27 16/11 11/16 27/0 27/0	11 <40 <40 11/0 0/11 7/4 4/7 11/0 7/4	24 <40 <40 0/24 24/0 0/24 0/24 0/24 0/24

注: CHB，慢性乙型肝炎组；ASC，HBV病毒携带者组；NC，健康对照组；数据示：平均值±标准差；括号中 + 和 − 代表血清相应抗原的阳性和阴性。

表3  荧光定量PCR仪检测到的各研究组8个目的基因的△Ct值

基因           CHB组（△Ct）      ASC组（△Ct）       NC组（△Ct）

CCR5           4.69±2.93             4.79±2.51            3.55 ±2.52   CTLA-4         1.87±2.65             2.48±1.78            2.24±1.39  Foxp3           0.42±2.22             0.95±0.91            1.38±0.82  GITR           -1.29±2.86*            0.11±4.45            1.31±1.67  ICAM-1         0.94±2.98             0.94±3.30            0.80±1.72  Neuropilin-1      -0.52±2.60            0.08±2.82            -1.56±1.93  TLR5            4.73±3.81             5.57±1.92            3.29±3.09  TLR8            0.42±2.77             2.82±2.88*           0.45±1.66

注: CHB，慢性乙型肝炎组；ASC，HBV病毒携带者组；NC，健康对照组；数据示：平均值±标准差；与健康对照组比较：* P<0.05。

 

图1. MACS免疫磁珠分选的CD4⁺CD25⁺ T细胞纯度>90％

图2.部分待测标本RNA电泳图

500bp 200bp 100bp

500bp 250bp 100bp

图3. 部分待测标本的cDNA用Foxp3做引物时常规PCR电泳图

图4. CHB组、ASC组与正常组外周血CD4⁺CD25⁺ Tregs CCR5、CTLA-4、Foxp3、 ICAM-1、GITR、TLR5、TLR8 和Neuropilin-1等分子荧光定量PCR结果