蒋冬花，李杰，后家衡，徐晓波

（浙江师范大学化学与生命科学学院  金华  321004）

摘 要: 从水果表面分离筛选到1株相对高产γ-氨基丁酸（GABA）的酵母菌菌株MJ2，经初步鉴定该菌株为啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。对菌株MJ2的发酵培养基和发酵条件用单因素轮换试验和正交试验进行整体优化。结果表明菌株MJ2转化富集GABA的适宜条件为：以可溶性淀粉为碳源、牛肉膏为氮源，初始pH 5.5、培养温度31 ℃、摇床速度180 r / min时，发酵培养3d，发酵液中GABA的产量最高可达7.539 g / L。

关键词:  γ-氨基丁酸；GABA；酵母菌；筛选；正交实验

中图分类号: Q93  文献标识码: A

Screening and Optimize Cultural Condition of a High γ-Aminobutyric Acid Producing Yeast from Fruit Surface

JIANG Dong-hua¹, LI jie, HOU Jia-heng, Xu Xiao-bo

( College of Chemistry and Life Science, Zhejiang Normal University, 321004，China)

Abstract：A strain of yeast which could produce γ-aminobutyric acid was isolated from fruit surface.  The selected yeast (MJ2) was identified as Saccharomyces cerevisiae, according to morphology and biochemistry.  The culture substrate and fermentation conditions of MJ2 were optimized by ways of single factor experiment and L₉（3⁴）orthogonal test.  The results showed that when soluble starch as carbon source, beef paste as nitrogen source, beginning pH 5.5, culture temperature at 31 ℃, shaking speed 180 r / min, the higher yield of γ-Amino butyric acid could be reached.  The content of GABA was 7.539 g / L in the optimum culture conditions.

Key Words:  γ-aminobutyric acid;  Yeast;  Screening;  Orthogonal experiment

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，简称GABA）是一种非蛋白质组成的天然氨基酸，由谷氨酸在谷氨酸脱羧酶的催化下脱去羧基而生成。1250年Florey和Robere小组从哺乳动物脑抽提液中发现了GABA；1452年发现GABA对哺乳动物中枢神经的抑制性作用；随后GABA的安神、预防老年痴呆、抗癫痫 ^[1]、降血压、活化肾功能、改善肝功能、防止肥胖、促进酒精代谢等多种生理功能 ^[2~4] 也相继被发现。在植物体中，GABA最熟悉的功能就是参与植物的胁迫反应 ^[5] ；此外还具有调节花粉管生长和植物生长方向的功能 ^[6] 。

富含GABA食品的开发始于1987年，日本农林水产省茶叶实验场津志田藤二郎等人将采摘下来的茶树鲜叶经6小时的N₂厌氧处理后产生了大量的GABA，含量由一般茶叶的加工法的30 mg/ 100 g增至200 mg/ 100 g，在动物实验和临床实验证实，以该鲜叶为原料加工成的绿茶具有显著的降血压效果，并建议将此茶命名为Gabaron Tea，即γ-氨基丁酸茶 ^[7] 。后来，日本茶业界将GABA茶的标准定为GABA含量在150 mg / 100 g 以上的茶叶 ^[7] 。日本在成功的把GABA茶商品化后，在1994年，日本农林水产省中国农业试验场又开发成功了富含GABA的米胚芽和米糠；接着又相继开发出富含GABA的发芽糙米，乳酸菌、酵母发酵的高GABA浓度的保健食品素材 ^[8] 。

酵母菌在酿造、食品、医药等工业上占有重要的地位。酵母菌的维生素、蛋白质含量高，可食用、药用和饲料用，又是提取核苷酸、辅酶A、细胞色素C、谷胱甘肽、三磷酸腺苷等多种生化产品的原料，还可用于生产维生素、氨基酸、有机酸等 ^{[9, 10]} 。近来国内出现一些以酵母为载体，补充微量营养素的保健食品和特殊营养食品，如富铁酵母、富硒酵母、富锌酵母等。即在生产酵母的培养基中，增加铁、硒、锌浓度，从而使酵母中含有较多的微量元素。各种以酵母为原料或载体的食品和添加都得到了很好的推广，其中既有酵母本身的有利条件，也说明了社会对酵母菌这种微生物的认可。在现今社会，人们对日常的保健和饮食的要求越来越高，必将导致保健食品消费的热潮，因此高产GABA酵母菌株的开发和应用将有良好的前景 ^{[9, 10]}。

1  材料和方法

1.1材料

1.1.1菌株来源

从梨、苹果、猕猴桃等水果表面不同部位分离酵母菌菌株，共获56株。

1.1.2培养基

① PDA培养基：马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，琼脂粉 20g，水1000 mL，pH 6.0 ^[11]。

② 查氏合成培养基（Cza）：葡萄糖 30 g，NaNO₃ 3g，酵母提取物 1 g，K₂HPO₄ 1 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，KCl 0.5 g，FeSO₄ ·7H₂O 0.01 g，琼脂粉 20 g，水1000 mL，pH 6.0 ^[11]。

③ 种子培养基：葡萄糖 50 g，蛋白胨 5 g，酵母膏 1 g，KH₂PO₄ 1 g，FeSO₄·7H₂O 0.01 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，水1000 mL，pH 6.0。

④ 菌种鉴定培养基：麦氏培养基、麦芽汁培养基、豆芽汁培养基、产酯培养基、糖发酵基础培养基、产类淀粉培养基、同化碳源基础培养基、同化氮源基础培养基、酵母汁琼脂培养基等按酵母菌鉴定手册 ^{[11, 13]} 配制。

 

1.2方法

1.2.1 酵母菌菌株的分离

用麦芽汁固体培养基26 ℃培养各种材料，分离纯化得到菌种 ^{[13~ 15]} 。PDA固体培养基26 ℃培养48 h，4℃冰箱保存备用。

1.2.2 菌种活化传代和发酵种子培养

用PDA固体斜面培养基进行菌种活化传代，菌株每四周转接一次。菌种转接到新的PDA固体平板上26 ℃活化培养48 h，再转接到种子培养基培养24 h用作发酵种子。

1.2.3 液体发酵培养和产GABA菌株初筛

250 mL三角瓶中装入50 mL Cza培养液（含0.5 %谷氨酸），按2 %的接种量接入菌种，26 ℃摇床培养48 h，取发酵液分析检测GABA产量，进行菌株筛选。

1.2.4 发酵液中GABA含量的测定

GABA的含量采用改良纸层析法测定 ^[16] ，准确定量由国家轻工食品监督检测中心用高效液相色谱仪测定。

1.2.5 发酵条件优化

培养基和培养条件进行单因素轮换试验如培养基碳源、氮源，培养温度、pH值、摇床振荡速度等筛选主要影响因素；用正交试验优化发酵条件找出各影响因素的最佳组合。

1.2.6 酵母菌菌株的鉴定

对选出的高产GABA酵母菌菌株按Barnett（巴尼特）等的酵母分类系统（1990）^[12]，根据个体形态、菌落特征和生理生化特性进行鉴定^[13~15]。

1.2.6.1 形态鉴定

观察记录菌落形态、细胞形态、假菌丝的形成、子囊孢子和掷孢子的产生等 ^[13~15]。

1.2.6.2 生理生化测定

进行产酯测定，碳源、氮源同化试验，类淀粉化合物测定，耐高渗透压测试，28℃生长试验等 ^[13] 。

2 结 果

2.1 酵母菌菌株的分离与纯化

通过分离、纯化和初步鉴定获56株酵母菌菌株。

2.2 产GABA酵母菌菌株的初筛

将各酵母菌菌株接入查氏合成培养液中发酵培养48 h检测GABA的含量。结果表明，来自不同水果表面的56株酵母菌菌株培养液中产生GABA能力有较大的差异，部分酵母菌菌株发酵液中GABA的产生见图1。

LZ1   LZ2   LZ3  MJ1  MJ2   PZ1  GABA  MD2   PZ3  MJ2  MD1  PZ2  PZ3  GABA

LZ1   LZ2   LZ3  MJ1  MJ2   PZ1  GABA   MD2  MD3  MJ2   MD1  PZ2  PZ3  GABA

 

 

 

 

图1  12株酵母菌菌株培养液中GABA产生的层析结果 样品点样量是5 μL，GABA点样量是1 μL Fig.1  The GABA production chromatographic separations’ result of 12 strains of yeast in fermentation medium  The quantity of GABA is 1 μL, and the specimen is 5 μL. 注：L代表梨，M代表猕猴桃，P代表苹果；D代表水果顶部，Z代表水果中部，J代表水果基部 Note：L means pear, M means kiwi berry, P means apple; D means the top, M means the middle, J means the base.

 

 

 

 

 

2.3 产GABA酵母菌菌株的复筛

从初筛结果可以看出，选出的56株酵母菌菌株发酵产生GABA的含量差异较大。因此，对所获产生GABA较明显酵母菌菌株进行第二次纸层析检测，洗脱后用分光光度计初步定量，以筛选GABA含量相对较高的菌株。复筛结果见表1，其中MJ2号菌株GABA产量最高为4.727 g / L，该菌株分离自猕猴桃基部表面。

表1  8株酵母菌菌株发酵液中GABA的产生

Table1  The GABA production of 8 strains of yeast in fermentation medium

菌株（strains）	MJ2	LZ3	LZ1	PZ3	PZ2	MD2	MD1	LZ2
GABA含量(g/L)	4.727	3.946	2.874	2.659	2.557	1.674	1.471	1.114
差异显著性 （0.05, 0.01）	a, A	b, B	c, C	c, C	c, C	d, D	d, D	e, E

注：GABA含量为三次测定的平均值；差异显著性经Duncan氏新复极差法检验，不同大小写字母分别表示在P≤0.01和P≤0.05水平上差异显著。下同。

Note：The GABA production is average yield of three repetitions.  Significance of difference is checked by Duncan’s SSR test.  Different letters means the difference in P≤0.01 level or in P≤0.05 level.  the same below.

2.4 培养基和发酵条件优化单因素轮换试验

2.4.1 培养基碳氮源对GABA产量的影响

以Cza液体培养基为基础，分别采用不同碳源和不同氮源进行试验（表2）。结果表明，以可溶性淀粉为碳源时发酵液中GABA含量相对较高，产量为5.124 g / L；牛肉膏为氮源时，GABA生成量最高，约为5.563 g / L（表2）。

表2  培养基碳氮源对MJ2酵母菌菌株发酵产生GABA的影响

Table2  The effects of carbon and nitrogen sources on the GABA production of yeast MJ2

2.4.2发酵条件对GABA产量的影响

将优化后的培养基调成不同初始pH、设置不同的培养温度和摇床转速进行试验（表3）。结果表明，培养基初始pH为5.0~6.0、培养温度为29℃~32℃、摇床的转速为180 r / min时，MJ2号酵母菌菌株发酵液中的GABA的含量最高（表3）。

表3  发酵条件对MJ2号酵母菌菌株发酵产GABA的影响

Table3  The effect of fermentation conditions on the GABA production of yeast MJ2

2.4.3 发酵条件优化正交优化

用优化培养基为基础，以培养温度、初始pH、摇床速度和培养时间为四因素，分别设3个水平，GABA产量为指标，对发酵条件整体优化进行L₉（3⁴）正交试验，试验方案见表4。

 

 

 

表4  正交实验优化发酵条件 / L₉（3⁴）

Table4  Optimization of fermentation condition using orthogonal experiment / L₉（3⁴）

实验结果见表5，极差分析见表6。四个因素对发酵液中GABA含量影响主次关系依次为培养初始pH>培养时间>培养温度>摇床速度，即初始pH影响最显著；最佳组合为A₂B₁C₂D₃，即培养温度31℃、初始pH 5.5、摇床速度180 r / min、培养时间为4d；优化发酵条件下GABA的产量提高到7.539 / L（国家轻工食品监督检测中心用高效液相色谱仪测定，图2）。

表5  发酵条件整体优化正交实验结果/L₉(3⁴)

Table5  The results of optimization of fermentation condition using orthogonal experiment /L₉（3⁴）

 

 

 

表6  发酵条件整体优化正交实验极差分析/L₉（3⁴）

 

Table6  The range analysis of optimization of fermentation condition using orthogonal experiment / L₉（3⁴）

注：均值Ⅰn、均值Ⅱn和均值Ⅲn分别表示第n列1、2和3水平所对应数据的均值.

Note: Ⅰn ,Ⅱn and Ⅲn means the average of the “n” list’s data at level 1, level 2 and level 3.

图2  GABA高效液相色谱图 Fig.2  Chromatogram of the γ-aminobutyric acid 注：A：GABA标准品高效液相色谱图，B：优化发酵条件下发酵液中GABA高效液相色谱图。 Note: A means chromatogram of the γ-aminobutyric acid standards, B means chromatogram of the γ-aminobutyric acid in sample of the optimum conditions.

A

B

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2.5 MJ2菌株的鉴定

 2.5.1形态特征

MJ2酵母菌菌株在麦芽汁琼脂上26℃培养 3d菌落圆形乳白色，有光泽，平坦，边缘整齐（图3A）；菌体细胞呈圆形、卵圆形和椭圆形，单个或成对出现，出芽生殖，大小为（10~12）μm×（6~8）μm（图3B）；在玉米粉琼脂平板培养基上于26℃下培养5d假菌丝不明显，8d后产生不典型藕节状排列有分叉的假菌丝；在麦氏培养基上26℃下培养3d未见子囊孢子的形成，5d后有圆形光面的子囊孢子生成（图3C）；培养20d未见有掷孢子产生。

图3  MJ2酵母菌菌株的形态特征 Fig.3  The morphological character of yeast MJ2 strain A 菌落, colony; B 菌体细胞，yeast cell（1000×）；C子囊孢子（1000×），ascospores

B

A

C

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2.5.2 生理生化特征

酵母菌MJ2菌株在产酯培养基上26 ℃培养3~5 d能闻到明显的酯类香气；能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖、棉子糖和乳糖，但不能发酵乳糖和蜜二糖。在被测的硫酸铵、硝酸钾、L-谷氨酸、亚硝酸钠等氮源中，不同化硝酸盐；没有类淀粉化合物产生；在葡萄糖浓度分别为50 %、60 %的高渗透压培养基中培养7~14 d可观察到该菌株均能生长，在28 ℃条件下生长良好。

根据以上形态特征和生理生化测定结果，参考中外酵母分类系统 ^{[12, 13]} ，将MJ2菌株初步鉴定为真菌门子囊菌亚门，半子囊菌纲内孢霉目，酵母菌科酵母菌亚科酵母菌属（Saccharomyces）啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

3 讨 论

人体内GABA的来源主要有两条途径，一是通过人类自身合成。但随着年龄的增大或者发生疾病等原因，自身合成GABA的能力会下降，因而不能满足自身的需求。另一途径是从食物中获取。但天然食物中GABA的含量很低。所以必须提高食物中GABA的含量，这就涉及到GABA在食物中富集的问题 ^[8] 。由于酵母菌与食品工艺的关系密切，因此筛选高产γ-氨基丁酸的酵母菌菌株具有较高的经济效益。

酵母菌菌体中GABA主要由L-谷氨酸（L-Glu）的脱羧反应而来，这一反应由L-谷氨酸脱羧酶（Glutamic Acid Decarboxylase，GAD）催化 ^[4] 。因此，在培养产生GABA酵母菌菌株时培养基中需要加入一定量的L-谷氨酸；又因为GABA的产生大都与逆境条件有关^[5] ，因此充分利用和创造逆境条件，可诱导酵母菌合成更多的GABA。影响GABA富集的主要因素有pH、温度、溶解氧等。各种逆境使细胞内部结构的破坏，使细胞质的pH值降低，这有利于谷氨酸脱羧（最适pH 5.5），不利于GABA的转氨作用（最适pH 8.9），从而积累GABA ^[6] 。

生物合成γ-氨基丁酸的酵母菌国内外研究很少。目前只有Takahashi 等（2004）从日本米酒中筛选到一株酿酒酵母，发酵液中GABA浓度为0.4 mM（约0.043 g / L）^[17]。国内未见有报道，我们从水果表面筛选出的酵母菌菌株GABA产量可达7.539 / L左右，属于高产菌株。

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